1. * 5651 Sayılı Kanun'a göre TÜM ÜYELERİMİZ yaptıkları paylaşımlardan sorumludur.
    * Telif hakkına konu olan eserlerin yasal olmayan şekilde paylaşıldığını ve yasal haklarının çiğnendiğini düşünen hak sahiplerinin İLETİŞİM bölümünden bize ulaşmaları durumunda ilgili şikayet incelenip gereği 1 (bir) hafta içinde gereği yapılacaktır.
    E-posta adresimiz

Elektoforetik Metotlar

Konusu 'Fen ve Teknoloji' forumundadır ve Çağlayağmur tarafından 18 Mayıs 2013 başlatılmıştır.

  1. Çağlayağmur
    Hoşgörülü

    Çağlayağmur ... Süper Moderatör

    Katılım:
    15 Aralık 2010
    Mesajlar:
    15.092
    Beğenileri:
    4.415
    Ödül Puanları:
    11.080
    Cinsiyet:
    Bayan
    Yer:
    Ankara
    Banka:
    794 ÇTL
    Elektroforez; çözeltideki iyonların elektrikakımının tesiri ile meydana gelen hareketlerinitanımlamak için kullanılan bir terimdir. Elektriksel alaniçerisindeki göç; elektrik akımının şiddetine, net yüke,molekülün şekline, solüsyonun iyonik gücüne,viskozitesine ve sıcaklığına bağlıdır. Göç hızı, proteinmolekülü üzerindeki yükün büyüklüğü ile doğruorantılıdır. İyonik bileşiklerin iyonlaşması, elektorforezintemelini oluşturur. Zıt yükteki elektrotlara doğru farklıhızlarda hareket eden değişik yükteki iyonlar elektrikselalanda birbirinden ayrılırlar. Elektroforez, ayrılmasıistenen iyonları ihtiva eden bir çözelti ile kağıt, nişastaagar, selüloz asetat zarı gibi inert bir taşıyıcı materyalinteşkil ettiği bir sistemde de yapılabilir (2, 12, 16). Proteinüzerindeki yüklerin birbirini dengelediği pH’ya oproteinin izoelektrik noktası (p1) adı verilir. Bu pH’daproteinler hem anod, hem katotdan aynı kuvvetleçekildikleri için proteinlerin bu pH’daki hareketleri sıfırolur (17, 18).Elektroforez çeşitleriKullanılan ayırma ortamının cinsine göre çeşitlielektroforez teknikleri kullanılmaktadır. Kağıtelektroforezi, selüloz asetat elektroforezi, agar jelelektroforezi, nişasta jel elektroforezi, poliakrilamidelektroforezi ve SDS-poliakrilamid jel elektroforezibunlar arasında sayılmaktadır (25, 28, 43, 44).Poliakrilamid jelPoliakrilamidin bir bağlayıcı (genellikle bisakrilamid) ile (polimerize edilmesi sonucu oluşturulur.Böylece rasgele büyüyen poliakrilamid ve bis akrilamidkonsantrasyonları oluşacak jelin yoğunluğunu,viskozitesini, elastikiyetini ve mekanik dağınıklığınıbelirler. Bu konsantrasyonların arttırılmasıyla oluşan ağınsıklığı da artmakta, buna bağlı olarak gözenek çapıazalmaktadır. Böylece içinden yürüyecekmakromoleküllerin hareketi, büyüklüklerine (molekülağırlıklarına) göre sınırlandırılmış olmaktadır. Akrilamidve bis için genellikle kullanılan konsantrasyonlar,incelenecek olan makromoleküllerin büyüklüğüne göreakrilamid miktarının bis miktarına oranı 10-100 arasındave akrilamid konsantrasyonu % 5’den büyük olur.Akrilamidin bis vasıtasıyla polimerizasyonunukatalizlemek amacıyla amonyum per sulfat (APS) vetetrametiletilendiamin (TEMED) kullanılmaktadır (43,44).Polyakrilamid jel izoelektrik odaklamayönteminin prensibiİzoelektrik odaklama, bir pH gradiyetinde yapılanelektroforezdir. Bunun için makromoleküller (+) ve (-)yüklere sahip oldukları müddetçe gradient boyuncaizoelektrik noktalarına rastlayan pH’ya kadar göç ederler.İzoelektrik noktada net elektriksel yük sıfırdır. pHgradienti düşük molekül ağırlıklı amfoterik maddelerin(amfolitler) yardımıyla oluşturulur. Eğer elektroforezdekullanılan tampon sistemi yerine anotta kuvvetli bir asit,katotta da kuvvetli bir baz kullanılır ve aradaki jelortamına da gerektiği kadar amfolit solusyonu katılırsaamfolitlerin anoda yakın kısmında (+) katoda yakınkısımda (-) net yükleri olur. Bundan dolayı elektrikverildiğinde bunlar anot ve katot tarafına itilerek merkezedoğru hareket ederler. Bu hareketleri sırasında çevreselortamın pH’sının kendi izoelektrik noktalarına eşit olduğubölgelerde hareketsiz kalırlar. Bundan dolayı, en asidikamfolitler katoda yakın olacak şekilde izoelektriknoktalarına göre sıralanırlar. Bunun sonucu jel içinde103YYÜ Vet Fak Derg 2003, 14 (2):102-106 Ekici ve Alişarlıanottan katoda doğru azalan bir pH gradienti oluşur (15,29). Numune tatbik edilip yürütüldüğünde proteinizoelektrik pH’sına geldiği anda net olarak yüksüzleşir.Hareket etmez ve o noktada odaklanır (1, 15, 29, 30, 44).Elektroforezde kullanılan jel boyama teknikleriElektroforez işleminden sonra jelin analizi içinboyama veya otoradyografi gibi yöntemlerden birisi tercihedilir. En çok kullanılan analitik yöntem CoomasieBrillant Blue R-250 veya gümüş nitrat ile boyamadır.Coomasie Brillant Blue R-250 sadece 1.0-0.5 mg proteinmiktarına kadar gümüş nitrat ise 10 ng protein miktarınakadar duyarlıdır. Eğer proteinler önceden bir radyoaktifizotop ile işaretlenmişse jelin analizi otoradyografi ilegerçekleştirilir. Otoradyografi radyasyon yardımı ile birradyografik film üzerinde iki veya üç boyutlu görüntüoluşturmaktadır. Görüntü çıplak gözle görülebilir. Ancakönceden bir radyoaktif izotop ile işaretlemeyi gerektirdiğiiçin oldukça pahalıdır (9, 40).Elektroforezin gıda analizlerinde uygulamalarıGıda proteinlerinin tayininde elektroforez tekniğiçok geniş uygulama bulmaktadır. Buğday ve buğdayürünlerindeki protein fraksiyonları elektroforez tekniği ileayrılabilmektedir. Elektroforez süt proteinlerininayırımında da kullanılmaktadır. Sütün başlıca proteiniolan kazein elektroforezden önce pH 4.6’da asetik asit ileçöktürülerek fraksiyonlarına ayrılmaktadır. Laktalbuminα, β ve γ laktoglobulinler olarak ayrılabilmektedir.Yoğurda hile amacıyla katılan jelatin proteinleri sütproteinlerinden gayet iyi ayırt edilebilmektedir. Bu metotile yoğurda % 0.05 oranında katılan jelatinbelirlenebilmektedir. Yine yumurta akı içerisinde bulunanyumurta proteinleri de karakteristik elektroforez bantlarıile belirlenebilmektedir.Elektroforez hile amacıyla yapılan karışımlarınbelirlenmesinde etkili bir yoldur. İnsan sütünün inek sütüile karışımı, koyun ve inek sütlerinden yapılmış çeşitlipeynirlerin belirlenmesinde elektroforez kullanılmaktadır.Elektroforez, proteinlerin ve enzimlerin saflığınınkontrolünde, oligo nükleotitlerin analizinde, proteinlerinmoleküler ağırlıklarının tespitinde, proteinlerin izoelektrikpH’larının belirlenmesinde ve enzimlerin preparatifeldesinde de kullanılmaktadır (11).Polyakrilamid jel izoelektrik fokuslama(PAGIF) tekniğinin et türlerinin ayırımındakullanılmasıElektroforetik tekniklerin numunelerdeki % 2-10arasındaki yabancı et karışımlarını tespit edebilmesi,dondurulmuş, çok küçük parçalara ayrılmış, kürlenmiş, 75°C’ye kadar ısıl işlemi görmüş ürünlerde uygulanabilmesive genetik olarak birbirine yakın hayvan türlerininetlerinin ayırt edebilmesi gibi avantajları bulunmaktadır(6, 14). Elektroforetik metotlardan PAGIF izoelektrikfokuslama tekniği etlerin hangi hayvana ait olduğununbelirlenmesinde kullanılmaktadır. Elektroforezde, etlerinyapılarındaki türlere özgü iyonize gruplar taşıyan yüklükas proteinlerinin belli bir pH derecesine sahip elektrikselalandaki hareket yeteneklerine göre etler ayırtedilmektedir. İzoelektrik fokuslama metodunun prensibielektroforez metodunun prensibi ile aynı olup burada jelinpH aralığı geniş tutulmuştur. Proteinlerin farklı pHderecesine sahip taşıyıcı ampholitte izoelektriknoktalarına göre elektroforetik ayrılmalarına dayanır.Yabancı etlerin teşhisinde elektroforetik metotlardanizoelektrik fokuslamayı, et orijinlerinin belirlenmesindeilk defa 1976 yılında Timbergen ve Olsman kullanmıştır(39). Daha sonra diğer araştırıcılar, et türlerininbelirlenmesinde izoelektrik fokuslama metodunukullanmışlardır (14, 20). PAGIF tekniği ayrıca balıktürlerinin belirlenmesinde de kullanılabilmektedir (20).Fakat elektroforetik tekniklerin kullanımında laboratuardabütün hayvan türlerine ait referans protein veya enzimbulundurulması zorunluluğu gibi zorlukları vardır (31).Bununla birlikte yine elektroforetik tekniklerin yerleşikkurulu bir laboratuara ve sistemin korunması için özelbakıma ihtiyaç duyulması, testi yapanların teknik düzeydeuzman olması, masraflı oluşu gibi zorlukları dabulunmaktadır (26).King ve ark. (24), düşük oranda çiğ sığır etinekarıştırılmış diğer et türlerini ayırmak için izoelektrikfokuslama yöntemini kullanmış ve fosfoglukonatdehidrogenase enzimini özel boyayarak et türlerinibirbirinden ayırmışlardır. King (23), PAGIF yöntemiyle,pişmiş etlerde özel enzim boyamasıyla et türleriniidentifiye etmiş ve bu amaçla sığır, koyun, keçi, kedi,köpek ve tavşan türlerini kullanmıştır. Decker ve ark. (5),PAGIF yöntemini kullanarak domuz, koyun, keçi vegeyik etlerini birbirinden ayırmışlardır. Gissel (10),polyakrilamid jel izoelektrik fokuslama tekniği ilebilinmeyen etlerden hayvan orijinlerini belirlemeyeçalışmış bunun için pH’ları 5.5 ile 8.5 arasında değişenhazır poliakrilamid jeller kullanmıştır. Rehbein (34),ultrathin-layer izoelektrik fokuslama yöntemiyle çiğ vepişmiş balık türlerini birbirinden ayırdığını bildirmiştir.Bauer ve Hoffman (3), PAGIF yöntemiylekaslarda bulunan peroksidaz enzimini kullanarak domuzve tavuk gibi az myoglobin içeren türleri birbirindenayırmışlardır. Bauer ve Hoffman (4), PAGIF yönteminikullanarak ısı işlemi görmüş et ve et ürünlerinden hayvanetlerinin türlerini birbirinden ayırmışlardır.PAGİF tekniği; etlerin hangi tür hayvana aitolduğunu veya et karışımlarında hangi türün yaklaşık neoranda bulunduğunu tespitte, güvenilir bir şekildekullanılabilecek bir metot olduğu anlaşılmaktadır. Ancakbu teknikle elden edilen elektroferogramlar değişikfaktörler tarafından etkilendiğinden, bunların yorumlanıpdeğerlendirilmesinde büyük özen gerekmektedir.Gerek dünya ve gerekse ülkemiz için et ve etürünlerini oluşturan türlerin, bunların karışımlarındaki türçeşitleri ve oranlarının belirlenmesi, halen güncelliğinikoruyan önemli bir sorundur. Hile amacıyla ucuz etlerinpahalı etler içerisine karıştırma oranın genelde % 20civarında olduğu tahmin edilmektedir. Düşük kalitelietlerin, kaliteli etlermiş gibi etiketlenip satılması fazla karyapmayı amaçlayan kişiler tarafından yapılmaktadır. Hileyoluyla daha fazla kazanç elde etmek için, karıştırma104Ekici ve Alişarlı YYÜ Vet Fak Derg 2003, 14 (2):102-106oranının olabildiğince yüksek tutulmasına çalışılmaktadır.Bu düşünceden hareketle, % 20 ve bunun üzerindekikarışımlar hile bakımından ekonomik olarak kabuledilmektedir(21).İmmunolojik metotlar, yakın tür hayvan etlerininayrımında cross reaksiyonların oluşması, ısıl işlemgörmüş et ve et ürünleri ayırımında kesin sonuçvermemesi gibi nedenlerle pratikte güvenli bir şekildekullanılamamaktadır.Ülkemizde gıda kontrol laboratuarlarında PAGIFtekniğinin et ve et ürünlerinde bulunabilecek et türlerininbelirlenmesinde rutin kontrol metodu olarakkullanılabilmesi mümkündür. Gerekli yasaldüzenlemelerin yapılarak, bu amaçla kurulacaklaboratuarlarda PAGIF metodunun da belirtilen gaye içinkullanımı temin edilebilir. Ayrıca immunolojik metotlarınrutin laboratuarlarda uygulanmasının zorlukları nedeniyle,rutin laboratuarlarda PAGIF’in uygulanabilmesi için, biran önce her tür hayvan etine uygun standart ekstraktlarüretilip ilgililerin hizmetine sunulmalıdır. Yine bu iş içingerekli teknik bilgiye sahip personel yetiştirilmelidir.

    [​IMG]
     

Sayfayı Paylaş