1. * 5651 Sayılı Kanun'a göre TÜM ÜYELERİMİZ yaptıkları paylaşımlardan sorumludur.
    * Telif hakkına konu olan eserlerin yasal olmayan şekilde paylaşıldığını ve yasal haklarının çiğnendiğini düşünen hak sahiplerinin İLETİŞİM bölümünden bize ulaşmaları durumunda ilgili şikayet incelenip gereği 1 (bir) hafta içinde gereği yapılacaktır.
    E-posta adresimiz

Mezenkimal Kök Hücre

Konusu 'Fen ve Teknoloji' forumundadır ve Çağlayağmur tarafından 18 Mayıs 2013 başlatılmıştır.

  1. Çağlayağmur
    Hoşgörülü

    Çağlayağmur ... Süper Moderatör

    Katılım:
    15 Aralık 2010
    Mesajlar:
    15.092
    Beğenileri:
    4.415
    Ödül Puanları:
    11.080
    Cinsiyet:
    Bayan
    Yer:
    Ankara
    Banka:
    794 ÇTL
    Canlılarda kendilerini yenileme ve farklılaşma (plastisite) kabiliyeti bulunan hücrelere kök hücre denir. Bu konuda ilk önemli öngörü Alman bilim adamı Carl Rudolph Wirchow'un 1800'lü yılların başındaki "Omnis cellula e cellula = tüm hücreler başka hücrelerden gelişir" yaklaşımıdırÜlkemizde bu konuda öncü sayılayabilecek ilk hücre kültürü çalışmaları sığır vebası ve şarbona karşı yeni aşı metotları da geliştirmiş olan Ord. Prof. Dr. Süreyya Tahsin Aygün'e aittir. Aygün 1971 yılında "örneğin kalp kültür hücresi enjekte edilen bir organizmada, kalbe yerleşiyor. Hücreler 2-7 ay içinde gelişiyor, 3545 gün içinde de hasta organı yeniliyor" diyerek zamanının ötesinde bir yaklaşımla hücrenin gücünü vurgulamıştır(1). Bu günkü manada ilk mezenkimal kök hücre (MKH) tanımlaması ise 1999 yılında Pittenger ve arkadaşları tarafından yapılan: "Kemik iliğinden köken alan ve uygun uyaranlarla üç temel seri; osteoblastik, adipositik ve kondrositik seriye farklılaşabilen fibroblastoid hücrelerdir" tanımıdır(2).

    Kök hücreler çoğalabilen ve ihtiyaç duyulduğunda görev yapacak olan hücrelere farklılaşarak olgunlaşmasını sağlayabilen hücrelerdir. Bunun en iyi örneği döllenmiş yumurtadır ki vücuttaki tüm hücrelere dönüşebilme potansiyeli olan bu ilk embriyonel hücreye "totipotent" hücre denmektedir. Fertilizasyonun yaklaşık beşinci gününde bu hücreler mezoderm endoderm ve ektodermden köken alan çok farklı hücre çeşidine dönüşebilme yeteneği olan "blastosist"e dönüşürler. Bu özelliğe sahip hücrelere de "pluripotent" hücreler denir. Hayatın ilerleyen dönemlerinde yerleştikleri dokunun hücre tipini üreten daha özelleşmiş erişkin tip kök hücreler ortaya çıkar. Kemik iliği kök hücreleri gibi olan bu hücrelere de "multipotent" hücreler denir(2,3,4).

    Kemik iliği kök hücreleri elde edilmesinin kolay olması, neoplastik diferansiyasyonun düşük olması, etik sorunların olmaması nedeniyle en fazla araştırma yapılan ve klinik kullanımı olan kök hücrelerdir. Kemik iliğinde hematopoetik kök hücreler, hemanjioblastlar, multipotent erişkin progenitör hücreler ve mezenkimal kök hücreler (MKH) şimdiye kadar izole edilen kök hücrelerdir. Bunlar içinde MKH'ler mezodermal kaynaklı adipositler, osteoblastlar, kon-drositler, tenositler, iskelet kas hücreleri ve visseral stromal hücrelere differansiye olabilmektedirler. Ancak MKH'ler bunun yanında ektodermal kaynaklı (nöronlar gibi) ve endodermal kaynaklı (hepatositler gibi) dokulara da diferansiye olabilmektedir. Biz bu yazımızda MKH'lerin, yapılan çalışmalar ışığında, kemik, kıkırdak, tendon ve kas gibi dokuların hastalıklarında kullanılma potansiyelini değerlendireceğiz..

    Literatürde 2000 yılı sonrası döneme baktığımızda mezankimal kök hücre biyolojisi, farklılaşması ve tedavide kullanım çabalarına ait çok sayıda yayınla karşılaşıyoruz.

    MKH'nin izolasyonu:


    MKH insanda genellikle süperior iliak kanattan alınan kemik iliği aspiratından elde edilir(2,5,6). Ancak femoral ve tibial medullar kısımlarından(7,8) ve torasik ve lomber vertebralardan da elde edilebilirler(9). Büyük hayvanlarda benzer bölgelerden alınırken kemirgenlerde daha çok tibia ve femur mid-diafizin-den alınır(10, 11). Kemik iliğinden elde edilen çekirdekli hücrelerin genç erişkin dönemde 1/10.000, erişkinde 1/250.000'i ve 80 yaşından sonrada 1/2.000.000'i ancak MKH'dir(1213). Heparinize edilmiş enjektöre alınan kemik iliği aspiratı serum fizyolojik veya PBS ( Phosphate Buffered Saline) ile seyreltilerek fikol dansite gradiyent yöntemi ile mononük-lear hücre ayrımı yapılır. Fikol süpernatantından ayrılan hücre çökeltisi %20-30 FBS (Fetal Bovine Serum) içeren DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) besiyerinde süspanse edilir. Hücre kültür flasklarında 48-72 saat 37 °C sıcaklıkta, %5 CO2 içeren humidifiye inkübitörlerde inkübe edilir. Bu süre sonunda süpernatant ve plastiğe yapışmayan hücreler aspire edilerek uzaklaştırılır. Geriye kalan plastiğe yapışmış hücreler kültüre edilmeye devam edilir. Hücreler flask tabanının %75'ini kaplayınca tripsinasyon işlemi yapılarak yapışan hücrelerin tabandan ayrılması sağlanır. Daha sonra hücreler bölünerek taze besiyerlerine ekilir. Ortalama 2-6 pasaj sonra yeterli sayıda hücre elde edilmiş olur. Kullanıma hazır hale gelen hücreler daha sonra çalışılmak üzere dondurularak -80°C ile -196°C de saklanır.

    MKH'nin Tanımlanması:


    Elde edilen hücrelerin MKH olduklarını gösterecek bir belirteç henüz ortaya konulamamıştır. Ancak bu işlemlerin 7. günü sonunda oluşan fibroblast kolonileri sayılır, buna CFÜ-F (Coloni Forming ünit Fibroblast) ölçümü denir. 104-105 mononüklear hücre için 1 adet MKH olduğu kabul edilir.

    Flowsitometrik olarak MKH'ler hematopoetik hücrelerin en önemli belirteci olan CD45 ve CD34+'ü taşımazlar (6, 15, 16). Fakat bu hücreler Thy-1 (CD90), CD106 (VCAM), J3-1 integrin CD29/CD49, CD10 ve CD13 gibi markerları ve PDGF, EGF, NGF ve 1GF1 gibi reseptörleri taşırlar(13). İmmun fenotipik karekteristikler ise primer hücrelerde değil kültüre hücrelerde görünür olur. Bildirilen karakteristik markerlar SH-2, SH-3 ve SH-4 dür. Ancak bu mark-erlarından hiçbiri MKH'ler için spesifik değilidir. Ek olarak MKH'ler HLA class-1'leride taşırlar.

    MKH'lerin "lineage" (dizi) değiştirmesi - kemik, kıkırdak ve yağ doku- kullanılan diğer bir fonksiyonel ayırıcı yöntemdir. MKH'lerin bu özelliği bir çok laboratuar yöntemle gösterilmiştir (6, 17,18). Kültüre edilmiş MKH'ler iğ şeklinde fibroblastik bir görünüme sahiptirler. Bunların osteogenik aktivasy-onu için J3-glycerol-phosphate, ascorbic acid-2-phosphate, dexamethasone ve fetal bovine serum içeren osteojenik diferansiasyon besiyeri kullanılır. Yaklaşık üç haftalık kültür sonucunda osteoblastik hücre görünümleri, kalsiyum birikimi ve alkalen fosfataz ekspresyonu göstermesi osteoblastik farklılaşma olarak değerlendirilir (19).

    Kondrojenik farklılaşmayı göstermek içinde hücreler ilk pasaj sonunda polipropilen tüp içinde pellet oluşturacak şekilde santrifüje edilir, üzerine 10ng/ml TGF J33 içeren kondrojenik besiyeri eklenerek dört hafta kültüre edilir. Bu durumda hücreler fibroblastik yapılarını hızla kaybederler ve kartilaj spesifik ekstra sellüler matriks özelliği gösterirler. Hücre morfolojileri hızlı şekilde değişiklik gösterir. Kültür sonunda Safranin-O boyası ile diferansiyasyon değerlendirilir (14,19).

    Adipojenik farklılaşmayı ortaya koymak için ise hücreler 0.1/^M deksametazon, 0.5 mM 3-izobutil -1-metilksantin, 10 ,u,g/ml rekombinant insan (rh) insülini, 0.2 mM indometazin ve serum içeren besi yeri ile kültüre edilir. Yaklaşık 3-4 siklus sonunda Oil-Red O boyası ile lipidden zengin vakuollerin intrasel-lüler birkiminin ortaya konması adipojenik diferansi-asyonun gerçekleştiğini gösterir. Ek olarak bu invit-ro farklılaşmalar ciltaltına yapılan implantasyonlar ile invivo olarak da gösterilebilir (14,19).

    Görüldüğü gibi MKH'lerin tanımlanmasında teknik sorunlar halen aşılamamıştır. MKH plastisitesini göstermede bu teknik sorunları aşmak için bu gün çoğunlukla donör hücre markerları kullanılmaktadır (Y koromozom , GFP+ ve J3-gal + hücreler gibi). Ancak yalancı pozitif sonuçlar halen ciddi bir sorun olmaya devam etmektedir.

    [​IMG]
     

Sayfayı Paylaş